вание критический эпитоп. Если кинетика связывания меченого и немеченого антигена различается, это следует учитывать в расчетах. Иногда, особенно при использовании меченых гаптенов, метка может улучшить распознавание. Это видно, когда меченый конъюгат использует то же положение на гаптене, что и ранее используемое в белковом носителе, требуемом для получения антител.

Сандвичевый анализ

□ В Сандвичевом иммунном анализе определяемое вещество из пробы захватывается избытком антител, а количество захваченного определяемого вещества оценивают с помощью второго антитела, образующего, таким образом, сандвич.

Как упомянуто ранее, место распознавания на антигене представляет собой небольшую зону, поэтому может быть несколько различных эпитопов, которые пространственно разделены на антигене. Эту особенность можно использовать в «сандвичевом» анализе; определяемое вещество захватывается антителом АЫ, что позволяет выделить его из остальной пробы. Захваченный антиген затем выдерживают с избытком второго, меченого антитела АЬ2, которое связывается только с уже существующими комплексами антитело-антиген (рис. 7.9-6).

Меченое антитело АЬ2 должно быть способно специфически соединяться с поверхностью связанного антигена. В идеальном случае сандвичевого анализа в отсутствие меченого антитела нет никакого сигнала. На практике всегда есть некоторый сигнал, возникающий за счет неспецифического связывания АЬ2 с АЫ, так что даже в отсутствие общего сигнала:

So = -BHCS06i4 (7.9-12)

где 5общ — сигнал, возникающий за счет [АЬ20бщ].

В присутствии слоя АЫ связывание Ag описывается константой KpaB„i в соответствии с уравнениями 7.9-1-7.9-6 (где АЫ = АЬ и KpaBI,i = Краю), но затем его контролируют с помощью присоединения АЬ2 к связанному антигену Agb, описываемого константой Крав„ 2'-

Контролируемый сигнал для связанного (АЬ2ь) и свободного (АЬ2/) меченого антитела должен различаться. Обычно измеряют связанное антитело, так что уравнение 7.9-13 означает, что будет полезным использовать избыток АЬ2, при котором соблюдаются условия

[Ab2f] » [АЬ2Ь] (7.9-14)

и уравнение 7.9-13 преобразуется в

[Agb] ю [АЬ2Ь] (7.9-15)

Однако существует оптимальная концентрация меченого антитела. Более высокие концентрации увеличивают неспецифическое связывание с захваченным антителом АЫ, а более низкие — больше подвержены ошибкам измерения.

Copyright © 2007-2012 Zomber.Ru

Использование материалов сайта возможно при условии указания активной ссылки
Решить химию