С другой стороны, концентрация АЫ не влияет на чувствительность до тех пор, пока его количества хватает для захвата антигена пробы (как правило, в концентрации больше чем ~ Ю-9 моль/л, но обычно выбирают ~ 10_6 моль/л, чтобы попасть в область постоянной степени связывания > 90%).

7.9.2. Варианты устройства Общее рассмотрение

В последнем разделе были очерчены основные теоретические принципы, но можно разработать почти неограниченное число вариантов связывания активных центров последовательностей и сандвичей, которые в конечном итоге достигают одной цели, а именно оценки концентрации определяемого вещества! Общими чертами классических методов иммунного анализа является то, что они определяют содержание не напрямую, а с помощью меченого аналога определяемого вещества или меченой системы распознавания определяемого вещества. Они также требуют разделения сигналов от свободного и связанного меченого маркера; это требование является первостепенным в иммунном анализе.

Разделение связанной и свободной фракций можно провести различными способами. В жидкофазном анализе растворов используют осаждение, центрифугирование и декантацию, но они дают весьма непостоянные результаты и поэтому не нашли широкого применения. Первый большой успех в этом направлении сделали Майлс и Хейлс (1968), которые предложили удалять несвязанные меченые антитела, вводя большой избыток антигена в твердой фазе (рис. 7.9-7).

Эта разработка положила начало развитию твердофазного иммунного анализа, в котором, однако, возникают дополнительные трудности, особенно в аспекте термодинамики взаимодействий. Твердофазный анализ отличается от анализа в жидкой фазе как по реакционной способности иммобилизованного антитела или антигена, так и по различию кинетики реакций в растворе и реакций, включающих твердую фазу (см. также разд. 7.8).

Эффекты поверхностной иммобилизации

□ Поверхностная иммобилизация может вызывать изменение конфигурации белка и в связи с этим изменение кинетики иммунного анализа.

В твердофазном иммунном анализе твердая фаза играет роль «несущей подложки». Ее, однако, нельзя рассматривать как пассивный компонент. Можно использовать и химическую, и физическую адсорбцию антитела или антигена, хотя большинство иммунных определений основано на физической, некова-лентной адсорбции. Как обсуждалось в разд. 7.8, даже физическая адсорбция представляет собой недостаточно изученный процесс. Связывание белков, по-видимому, имеет гидрофобную природу, и все же в естественной конфигурации белков в водном растворе гидрофильные группы стремятся расположиться на поверхности, а гидрофобные группы — внутри полимера. Следовательно, связывание с гидрофобными поверхностями неизбежно вызывает изменение кон-

Copyright © 2007-2012 Zomber.Ru

Использование материалов сайта возможно при условии указания активной ссылки
Решить химию