формации белка, что может привести к потере критических эпитопов, либо потому что они будут спрятаны, либо потому что сам эпитоп гидрофобен и участвует в связывании. Значит, нет ничего необычного в том, что находятся антитела, которые хорошо работают в жидкой фазе, но терпят неудачу в твердофазных системах.

Трудность разработки теоретической модели твердофазного иммунного анализа состоит также в том, что ряд основных допущений и понятий не полностью применимы. В большинстве твердофазных определений константа скорости прямой реакции между частицами в растворе и иммобилизованной распознающей фазой ограничена диффузией, а не константой сродства, относящейся к акту распознавания. Первостепенное влияние оказывают вязкость анализируемого раствора и относительное распределение активных центров, но также влияет и степень упорядочения частиц раствора при приближении к поверхности.

Поскольку биораспознающая поверхность является твердой фазой, структура пограничного слоя на ее поверхности влияет на реакцию и достижение стационарности. Хотя термин «концентрация» не очень подходит для рассмотрения фазы иммобилизованного реагента в растворе, однако в граничном слое локальная «концентрация» иммобилизованного реагента очень высока. Рассмотрим, к примеру, иммобилизованное на поверхности антитело в растворе, содержащем антиген (рис. 7.9-8). Антиген связывается с иммобилизованным антителом, вызывая обеднение антигеном слоя, ближайшего к поверхности, которое восполняется антигеном из объема раствора, причем процесс этот ограничен диффузией.

Поверхность фазы носителя рассматривают в целом как имеющую однородное распределение иммобилизованных антител, но это очевидное упрощение. Существует доказательство, что поверхность имеет фрактальную геометрию, где адсорбированные антитела собраны в островки высокой плотности, разделенные областями с малой населенностью (рис. 7.9-8,6). Обычное равновесие ассоциации/диссоциации между антителом и антигеном также имеет тенденцию к нарушению, поскольку крайне высокая «локальная» поверхностная концентрация антител в островных кластерах препятствует диссоциации антигена, и поэтому, если антиген был уже связан, процесс в значительной степени становится необратимым.

Физические методы разделения связанной и свободной метки

□ Разделение связанной и свободной метки не должно нарушать равновесия между ними.

Идеальный метод разделения не должен оказывать влияния на соотношение связанной и свободной метки и должен обеспечивать полное разделение обеих форм. Однако, как было установлено ранее, достичь этого никогда не удается. В любом случае связывание рецептор-лиганд обратимо, поэтому процедура разделения не должна изменять условия реакции, чтобы диссоциация не происходила. Большое разнообразие применяемых методов разделения отражает разнородность свойств комплекса рецептор-лиганд и требований к ме-

Copyright © 2007-2012 Zomber.Ru

Использование материалов сайта возможно при условии указания активной ссылки
Решить химию