но использовать лишь тогда, когда коныогат антиген-метка достаточно мал, чтобы обеспечить эффективное разделение.

Хроматография

Во многих определениях существует значительная разница в размерах рецептора и лиганда. Антитела имеют молекулярные массы порядка 160 ООО и могут быть легко отделены от антигенов с молекулярной массой менее 80 ООО. Наиболее широко для этой цели применяется эксклюзионная гель-фильтрующая хроматография. Небольшой свободный меченый антиген удерживается на колонке, в то время как объемистый комплекс антиген-антитело элюируется. Метод обеспечивает хорошее разделение, но он дорог и требует затрат времени, так что он не подходит для рутинного, многократного использования.

Твердофазные носители

В этих методах первичная распознающая система присоединена к твердому носителю. Общим свойством этих методов является их низкое неспецифическое связывание, сравнимое с жидкофазным анализом, особенно при введении этапов промывки для уменьшения неспецифичных эффектов. Выбор метода опять-таки зависит от факторов целесообразности и технических характеристик. Возможные компромиссные варианты приведены в табл. 7.9-1.

Шарики и частицы

Для твердофазной иммобилизации более всего подходят стеклянные шарики. IgG адсорбируется либо на стеклянную, либо на пластиковую поверхность, так что это метод пассивной иммобилизации, оптимальный при нейтральном рН. Высокую загрузку белка получают при таких размерах частиц^ которые обеспечивают адсорбцию 10-15% белка из раствора. Используют также кова-лентное присоединение, но это обычно требует большей подготовки иммобилизованного слоя (химия связывания подобна изображенной на рис 7.8-7 и 7.8-8). Потребность в этом определяется приложением и дальнейшей обработкой иммобилизованного IgG.

Диаметр частицы не обязательно напрямую определяет емкость связывания, поскольку она зависит также от площади и природы поверхности. Однако установлено, что сефадекс и целлюлоза обычно имеют более высокую емкость связывания, чем найлон, полистирол или стекло, хотя два последних можно легко приготовить в виде более мелких частиц.

□ Твердофазными носителями могут быть частицы произвольной формы, шарики и поверхности; площадь реагирующей поверхности оказывает влияние на емкость связывания.

Среди сыпучих материалов наиболее распространен латекс (диаметр < 20 мкм) благодаря его сферической геометрии н большой удельной поверхности. Его плотность близка к плотности воды, так что на протяжении анализа он остается во взвешенном состоянии. Разделение о<зтцествляют затем с помощью центрифугирования, декантации, микрофильтрации и т. п. Однако

Copyright © 2007-2012 Zomber.Ru

Использование материалов сайта возможно при условии указания активной ссылки
Решить химию