буется разделения связанной и свободной фаз. Тупштель представляет собой акцепторную молекулу, например, на антителе (рис. 7.9-13), с максимумом возбуждения, близким к длине волны испускания исходного «донориого» флуорофора, который находится на антигене. Скорость передачи обратно пропорциональна шестой степени расстояния между молекулами и зависит также от квантового выхода и «соответствия» между длинами волн донора и акцептора.

где Ф9 и Фо — квантовые выходы донора в присутствии и в отсутствие акцептора, а До—расстояние, иа котором эфсрективность передачи составляет 50%.

Постоянно используемой парой акцептор—донор являются флуоресцеин и родамин, а получаемое 50%-ное уменьшение флуоресценции донора на ~ 50 Асравнимо с типичным внутримолекулярным расстоянием между рецепторами в IgG (порядка 100 А). Чтобы добиться максимальной близости между донором и акцептором, маркирование антитела следует проводить близко к месту связывания; однако такая направленная модификация антитела меткой затруднительна из-за недостатка уникальных групп в структуре белка. Следовательно, вводят несколько флуорофоров в случайном порядке, но слишком высокий уровень маркирования может привести к нерастворимости, поэтому типичным значением является 10-12 флуорофоров на одну молекулу IgG. Похожие рассуждения применяют и для донора, но в случае гаптена это соотношение может быть ограничено конъюгатом 1:1, а для белка высокая загрузка флуорофора приводит к уменьшению квантовой эффективности из-за самотушения. В принципе, регистрация испускания акцептора должна давать лучший сигнал, но поскольку некоторое прямое возбуждение акцептора может происходить и при длине волны возбуждения донора, это приводит к высокому фону. Выбором, следовательно, является контроль тушения флуоресценции донора.

Для того чтобы отличить сигнал от фона, а в некоторых случаях разделить сигналы связанного и несвязанного меченого антигена, можно использовать и другие молекулярные свойства. Например, когда антиген мал, меченный флуоресцеином аналог способен вращаться с высокой скоростью, а комплекс с антителом имеет значительно меньшую скорость вращения. При возбуждении популяции флуоресцентных молекул линейно поляризованным светом, вероятность возбуждения любой отдельной молекулы определяется ее ориентацией. Если «заморозить» молекулу в определенном положении, так что вращения не происходит, то в результате наблюдают флуоресценцию в плоскостях поперечного электрического (ТЕ, ±) и поперечного магнитного (ТМ, ||) полей по отдельности, а максимальное значение поляризации Р равно 0,5:

P = TLTTL <7*9-21)

Т||+Т±

Усиление броуновского движения приводит к уменьшению поляризации. Этот принцип используют во флуоресцентной поляризации, поскольку вращение меченого флуоресцирующего антигена уменьшается при связывании с антителом (рис. 7.9-14). Таким образом, при низкой концентрации антигена в

Copyright © 2007-2012 Zomber.Ru

Использование материалов сайта возможно при условии указания активной ссылки
Решить химию